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博士三板斧---安全有效使用蛭弧菌防治弧菌病

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發表時間:2019-03-22 00:23


近兩年,蛭弧菌產品的使用又突然火了起來,市面上也出現了各式各樣的蛭弧菌產品,有液體蛭弧菌,有粉劑蛭弧菌,還有蛭弧菌凍干粉但是同樣都是蛭弧菌,有的產品用的很好,有的產品用的卻見不到效果,很多養殖戶甚至廠家都對蛭弧菌相關產品抱有疑問,本文則希望通過對蛭弧菌知識的初步梳理,為養殖戶、經銷商、公司更好的理解、使用蛭弧菌產品的使用提供一些思路。

一、到底什么是蛭弧菌?

(一)蛭弧菌發現及命名

蛭弧菌是在1962年由StolpPetzold首次發現于菜豆葉燒病假單胞菌體中,隨后從土壤、污水中都分離到了這種細菌。所以蛭弧菌從發現到現在才不過56年的時間。

蛭弧菌命名為Bdellovibriobacteriovorus。其中,Bdello一詞來自希臘字,是水蛭的意思,“vibrio”意為弧菌,而種名“bacteriovorus”食細菌的意思。其命名很有意思,水蛭代表了其生理上的一些動作形為,蛭弧菌的捕食生活方式很特殊,它是寄生于其他細菌并能導致其裂解的一類細菌——請注意,是裂解,不是整個吃掉哦。

(二)蛭弧菌的基本情況

蛭弧菌也叫噬菌蛭弧菌,屬于細菌界變形細菌門蛭弧菌科蛭弧菌屬,具有細菌的一切形態特征:單細胞,弧形或逗點狀,有時呈螺旋狀。0.3-0.6×0.8-1.2微米,或僅為桿菌長度的1/3-1/4,端生鞭毛,比其他細菌的鞭毛粗3-4倍,與鞭毛相對的一端有釘狀纖毛,被稱為感染錐子,與菌體的識別和吸附宿主有關。其運動活躍。革蘭氏染色陰性。

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有幾點要特別說明下

第一、蛭弧菌比通常的細菌要小,能通過細菌濾器,所以普通的顯微鏡是看不到它的,至少要用到油鏡,甚至需要染色才行。

第二、在相差顯微鏡下,可見蛭弧菌呈跳躍式的運動。電鏡觀察,蛭弧菌以弧、桿狀為主。

第三、就是因為小,所以,低于2萬轉的離心機對蛭弧菌的濃縮都是沒有意義的,而2萬轉的離心機則一般是實驗室才會配備,而且容易小,對實際生產而言,應用還有些距離。

(三)蛭弧菌生活方式及生長要求

蛭弧菌有寄生型,也有兼性寄生,極少數營腐生。非寄生型營腐生生活,可在蛋白胨和酵母提取物培養基上生長繁殖。從自然界分離得到的蛭弧菌都是依賴寄生型,迄今為止,還沒有直接從自然界分離得到非寄生型。不依賴宿主的蛭弧菌,只能生活在實驗室條件下。

寄生型蛭弧菌生長,一般要求pH6.0-8.5;溫度23-37℃,低于12℃,高于42℃時均不生長;能穩定分解蛋白質,一般不利用碳水化合物,而以肽、氨基酸作碳源和能源;能液化明膠;嚴格好氧。

——所以請注意以下幾點:

第一、溫度不在適宜范圍的時候,蛭弧菌是不生長的,所以使用時要充分考慮這一點。比如34月份用它用泡苗,效果肯定不會好,但如果改成拌料投喂,會對腸道控菌產生積極影響。

第二、蛭弧菌的繁殖是需要氧氣的,使用的時候也建議在早上8-10點使用,這樣可以獲得較為充足的溶氧。另外,其耗氧不會達到非常劇烈的程度,因為其繁殖代時一般要4-6小時。

(四)寄生的特異性問題

蛭弧菌與宿主細胞之間,常表現出一定的特異性。不過,有的特異性較差,能侵入多種細菌。例如不同的蛭弧菌菌株,能侵入各類不同的植物病原菌。

從這一點上看,其比噬菌體(病毒)、細菌素(蛋白質)的廣譜性要好。實際上蛭弧菌可感染許多不同科屬的菌,但其總體上有一定偏向性,比如其可感染大多數革蘭氏陰性細菌(如志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、埃希氏菌屬、歐文氏菌屬、變形桿菌屬、弧菌屬、假單胞菌屬、鉤端螺旋體等微生物),但只對少數的革蘭氏陽性(如糞鏈球菌、乳酸菌等)細菌感興趣,比如其就不裂解枯草桿菌,同時也有報道指出其對某些真菌和腸道病毒也有一定的裂解活性。

——寄生的特異性也對我們的實際使用方法有很大的影響,即蛭弧菌是不是不管好菌壞菌都會攻擊?如果是這樣的話,那么很難被我們所用了,但實際上,其有一定傾向性,這就給我們實際的應用提供了更多的可能性。

郭衍彪(2016年)的研究指出,蛭弧菌BDW03對試驗組大菱鲆腸道沒有控制作用的菌屬為8個(占53.3%),這8個菌屬中多為革蘭氏陽性菌屬(6/8)。另外,其通過乳酸菌拌食餌料和潑灑BALOs喂食大菱鲆60d后,乳酸菌和BALOs對大菱鲆腸道菌群中革蘭氏陰性菌的控制作用(分別占總菌屬的33.3%26.7%)優于對革蘭氏陽性菌的控制作用(分別占總菌屬的(26.7%20.0%)。這也間接指出了蛭弧菌對細菌的裂解可能有一定的偏向性。

徐琴等人(2009)的研究指出,加噬菌蛭弧菌和黏紅酵母組的試驗效果不理想,表明這兩株菌體之間有一定的拮抗作用。而聯合使用噬菌蛭弧菌和球形紅假單胞菌(是紫色非硫光合細菌紅假單胞菌屬的一個種)組展示了凈化水質,預防病害的優良前景,此組能有效地吸收氨氮、硫化物等有害物質。這也指出了蛭弧菌是直接可以和某些光合細菌直接混合使用的,這一點大大提高了使用的方便性。

另外,陳家長等人(2003年)曾在螃蟹養殖中,間隔使用光合細菌和蛭弧菌:每20天用噬菌蛭弧菌和光合細菌各1,使用方法為使用光合細菌1 周后使用噬菌蛭弧菌,實驗周期 3個月。其中蛭弧菌濃度為107cfu/mL,光合細菌為109cfu/mL。這樣間隔使用的效果也非常不錯,25d后養殖中華絨螯蟹驗組比對照組池塘中的細菌總數少2個數量級,70d 后實驗組比對照組池塘中的細菌總數少3個數量級,另外試驗池塘的COD、氨氮及硫化物有明顯的降低,有效的提高了中華絨螯蟹的成活率,但是本文并沒有探討如何混合使用。

再加上其他專家的一些總結,基本上,蛭弧菌更偏向于革蘭氏陰性桿菌,同時從即有的論文得知,其最好不要用酵母混用,但蛭弧菌可以和光合細菌混用,當然,建議最好分開使用。同時還有一個關鍵點,即在一個20天的周期內,蛭弧菌對水體的調控作用能達到近2周時間。

(五)蛭弧菌為什么用雙層平板而不用單層平板法檢測?

主要的原因在于培養皿底部并不是十分平整,因此注入少量培養基鋪平底部作為下層,會獲得幾近水平的底部,然后在上面將噬菌體和細菌混合物的培養基(比較薄)注入作為上層,這樣使得觀察物在同一平面,更利于噬菌斑的觀察及分離純化。

實際上單層平板法與雙層平板法所形成的噬菌斑的比較圖如下:

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(六)安全性問題

王亞麗(2007年)的研究指出,將分蛭弧菌離株BD5W107pfu/mL濃度給小鼠灌胃,試驗組和對照組均健康,證明噬菌蛭弧菌對小鼠沒有毒性作用。

林茂等(2010年)的研究也證實了蛭弧菌作為一種微生態制劑的無毒無害特點。

徐懿(2011年)在噬菌蛭弧菌BD57的急性毒性試驗研究指出,根據《獸藥試驗技術規范匯編》的要求選用小白鼠進行了急性毒性試驗。分別采用灌胃和腹腔注射法進行了急性毒性試驗,試驗結果表明,噬菌蛭弧菌BD57 對小鼠沒有毒性作用。

陳麗蕓(2012年)的研究也指出,至今沒有發現蛭弧菌對真核細胞有毒的報道,對小白鼠、豚鼠、家兔等動物無毒性作用,對猴腎、Hela細胞組織培養也未引起細胞病變。迄今為止,相關報道表明蛭弧菌對人和某些動物無毒害作用。

二、蛭弧菌的裂解機制

蛭弧菌對于宿主菌的裂解過程一般分為五個步驟:識別、吸附與侵入、定位與合成、復制、裂解。整體示意如下圖:

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1、識別

蛭弧菌的化學趨避運動是其識別宿主菌細胞的重要方式,蛭弧菌識別宿主并非用其化學趨避性直接去識別感染,而是在含有某些氨基酸及化合物的環境中,通過化學趨向性,尋找碳源和能源,以緩和饑餓狀態,這樣蛭弧菌聚集在宿主菌所需的營養物質周圍,而宿主菌也向營養物質接近,使局部環境中的宿主菌濃度升高,因此,增加了蛭弧菌對宿主菌侵染和吸附的機會。

在這個過程中,有趣的是蛭弧菌可以通過鞭毛實現跳躍式的運動,而向宿主菌快速移動,其是通過無鞭毛一端粘附于宿主菌表面的。鞭毛在這里起到了非常重要的作用,實際上,在一些發酵的試驗研究過程中也發現,如果發酵罐內的漿葉轉速過快,對鞭毛有損傷的話,蛭弧菌就無法再攻擊宿主。

2、吸附與侵入

為了實現吸附與侵入這個目的,蛭弧菌菌體會以100/秒以上的速度產生一種機械鉆孔效應,加上蛭弧菌入侵時的收縮從而進入宿主菌的周質空間

3、定位與合成

一是蛭弧菌會脫掉鞭毛,二是宿主菌會變成蛭質體。

4、復制

蛭弧菌在這個階段實現了復制繁殖。蛭弧菌繁殖一代需4~6h,每次可復制6~36 個子代細胞。

5、裂解

在最后一個過程中,蛭弧菌會合成鞭毛,裂解宿主的細胞膜,釋放出所有蛭弧菌。

電鏡的一些圖片如下:

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三、蛭弧菌的保存方式研究

黃文等人(2002年)曾對五種蛭弧菌的保存方法做了對比研究,其指出5種保藏方法中以冷凍干燥法保藏效果最好,21個月的復活率為100%,其次為4℃營養肉湯液保藏法和-20℃甘油保藏法,17個月復活率均為67%

當然,有一點要明確,其冷凍干燥完成之后,是在4℃環境中進行保存的。

另外,鄧璐等人(2008年)研究了不同的保護液、保藏溫度和保藏載體的選擇對蛭弧菌長期保藏的影響,以及對優化保藏條件下的蛭弧菌復蘇率和復蘇蛭弧菌的噬菌能力檢測,并且對保藏期限內宿主菌的存活情況與蛭弧菌的存活情況的相互影響做了首次的報道。結果表明:1/100NB等低營養液體為保護液、瓊脂為載體、加入適量宿主菌于4℃,蛭弧菌保存可達2年以上,保存期內蛭弧菌的復蘇率和出斑數目較對照組都有極其顯著的提高(P<0.01)

目前常溫保存的研究還未查到,所以建議蛭弧菌產品最好存放于4℃環境中,實際上普通的立式冷藏冰柜就可以滿足這個條件。

四、蛭弧菌的使用方法

蛭弧菌到底在實際中應該如何使用?這必需要結合蛭弧菌本身的特點,同時考慮現實問題,才能真正發揮最大效果。實際的用法建議如下:

特別推薦在所有甲殼類養殖動物(小龍蝦、螃蟹、白蝦等)脫殼期之前使用,達到無刺激生物消毒這個效果。

1、則脫殼期是這些養殖動物特別脆弱的時期,容易感染相關疾病,尤其是溫度升高的時候更是如此;另外,在脫殼期,甲殼類動物特別敏感,很多消毒劑是不能使用的,而蛭弧菌則可以做到安全無刺激;使用上,建議提前2天左右使用,如果能先使用博士超能鈣之后再使用噬菌博士和噬菌120那就更好了,因為一定量的鈣離子可以促進蛭弧菌的繁殖。

2、推廣配合化學消毒劑治療疑難雜癥

到了養殖中后期,在溫度高的時候,有些疾病非常難以治療,主要的特點是止不住、易反復

為了讓殺菌即迅速又持久,則必需結合使用博士消毒液、博士精碘化學消毒劑噬菌博士和噬菌120蛭弧產品。首先使用博士消毒液、博士精碘對水底、水面進行綜合消毒,必要時結合博士全效底改、分解底改、高效過硫顆粒等化學底改做到水體池底全方位消毒,在見到效果之后使用水博士、VC解毒靈進行水體解毒,再連續使用1-2噬菌博士或噬菌120蛭弧菌產品,就可以看到明顯的治療效果。因為化學消毒劑起到了快速壓制的效果,而蛭弧菌則起到了長期壓制有害菌的效果,強強聯合,能有效的抑制有害菌的繁殖。這同時也符合“博士3板斧”的“化學消毒+有機酸解毒+生物消毒占位”核心原則。

3、建議預防使用,降低發病率

在使用過高效過硫顆粒后,第二天可以大劑量使用有益菌,此時建議使用噬菌博士或噬菌120博士光合菌一起混合使用,這一點已通過試驗證明是可行的。

當然也可以按20天一個周期,先行使用光合細菌,一周后再使用蛭弧菌,也能達到比較好的使用效果。

何義進等人(1996年)所做的室外小水體試驗結果表明,在使用蛭弧菌的水體中,除DOpH 比較穩定外,其它水質理化指標NH4-NNO2-N、總磷和透明度都或多或少地發生了一些變化。

4、建議拌料防治腸炎

蛭弧菌產品最早是做為獸藥在畜禽上推廣使用的,在畜禽上大部分是做為治療腸炎存在,尤其是針對剛出生的小豬小雞。

那么,在水產上如何推廣呢?蛭弧菌其實主要針對大腸桿菌引起的相關腸炎疾病,因為在發酵蛭弧菌之前,必需先行生產大腸桿菌,再將蛭弧菌接種進去,大腸桿菌是蛭弧菌最為喜愛的細菌之一,因此其治療此類腸炎效果會更好一些。

另外,蛭弧菌本身就是一個寶庫,其的蛋白質含量豐富,可達細胞干重的60%~65%DNA的含量為5%


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